谐波成像

谐波成像是近年发展起来的一种三维光学成像技术 , 具有非线性光学成像所特有的高空间分辨率和高成像深度 , 可避免双光子荧光成像中的荧光漂白效应 , 是一种理想的非侵入生物活体成像方法。生物组织的病变往往会引起微观结构的变化 , 而二次谐波信号对组织的结构对称性变化高度敏感 , 因此二次谐波成像对于某些疾病的早期诊断或术后治疗监测 , 具有很好的生物医学应用前景。

谐波成像介绍

谐波成像是近年发展起来的一种三维光学成像技术 , 具有非线性光学成像所特有的高空间分辨率和高成像深度 , 可避免双光子荧光成像中的荧光漂白效应 , 是一种理想的非侵入生物活体成像方法。生物组织的病变往往会引起微观结构的变化 , 而二次谐波信号对组织的结构对称性变化高度敏感 , 因此二次谐波成像对于某些疾病的早期诊断或术后治疗监测 , 具有很好的生物医学应用前景。

谐波成像背景简介

谐波成像背景

1961年红宝石激光器发明不久 , Franken等人用红宝石激光器输出波长为 694 nm激光穿过一个石英晶体时 , 产生 347 nm 的紫外光。这是最早观察到的光学二次谐波 ( second harmonic generation, SHG) 现象 , 标志着非线性光学的诞生。 从此 ，SHG被用于倍频激光器以得到短波长激光。近年随着激光技术、检测技术和计算机技术的快速发展， 利用二次谐波进行生物组织的三维成像成为生物医学成像领域中的热门课题。引起广泛关注。

谐波成像技术简介

SHG是一个二阶非线性过程 , 二次谐波成像具有与双光子激发荧光 ( two-photon excited fluorescence, TPEF) 显微成像类似的特性。如 SHG和TPEF的激发效率与激发光的平方成正比 , 因此仅在焦点附近才有足够的光子能量来激发 , 非线性效应的强局域性减少了成像时非焦点处发光产生的背景干扰 , 提高了信噪比和三维空间分辨率； 同时使得非焦平面上的光漂白和光毒性大大降低 , 因此能长时间对样品进行成像而不影响其活性。 由于二次谐波显微成像使用近红外的激发光 , 组织吸收和散射效应最小 , 激发光能深入组织内部 , 相比传统的显微镜 , 如激光扫描共焦显微镜 , 可以做更深层的成像。此外 , 二次谐波成像技术的发射与激发波长相距较远 , 因此信号易于有效分离。

对活体生物样品 , SHG还具有一些独特的优点。SHG一般为非共振过程 , 光子在生物样品中只发生非线性散射 , 不被吸收 , 因此不产生伴随的光化学过程 , 可减小对生物样品的损伤。另外 , 在许多情况下 , 组织的病变过程中的线性光学特性变化很小 , 传统的线性光学成像技术不能检测。生物组织发生病变时一般都会伴随着组织结构、细胞形态及分子结构的变化 , SHG对组织微观结构变化高度敏感 , 所以有望将该方法用于某些疾病 (如糖尿病、动脉硬化和一些视网膜疾病等 ) 的早期检测和诊断。 二次谐波显微成像技术不需进行样品染色 ,因此对某些不能进行荧光标记的样品 , 采用二次谐波显微成像技术检测有效。

谐波成像谐波成像原理

介质在强激光作用下 , 电极化强度与入射辐射的场强E间的关系可表示为

P =ε₀( χE +χE+χE+ …)

其中 , χ 是一阶电极化率或线性电极化率 ；χ 、χ 为二阶、三阶非线性电极化率张量。 ε₀χE 正是 SHG和 TPEF等二阶非线性光学效应的根源。假设入射光的场强为 E₁ cos(ωt + φ) , 由式(1) 可知 , 入射光产生的二阶非线性电极化强度为 1/2ε₀χE₁+1/2 ε₀χE₁ cos(ωt +φ) 。其中 , 第二项为二倍频成分。即在电偶极子近似下 , 非中心对称分子在频率为 ω的入射光场作用下 , 辐射光除有线性的频率成分 ω外 , 还包含了频率为 0和2ω的非线性成分。当散射介质中分子群产生的以2ω为频率的非线性散射成分相干 , 就称为二次谐波产生。

SHG的一个主要条件是需要没有反演对称的介质。当电偶极子近似时 , 在中心对称的样品中产生的电极化强度方向相反且大小相等 , 因此相互抵消 , 二阶电极化率张量为零 , 即没有 SHG。

SHG还必须满足相位匹配条件。如果满足完全相位匹配条件 , 则传播中的倍频光波和不断产生的倍频极化波间保持了相位的一致性 , 相互干涉 , 产生的二次谐波振幅由零开始 , 至基波的功率全转变为二次谐波的功率 , 最终二次谐波的输出最大。

此外 , SHG还与样品的非线性光学系数 d_eff 有关 ,d_eff越大越能有效产生二次谐波。 d_eff大的介质 ,满足相位匹配条件时 , 能有效产生二次谐波.二次谐波的相干性使二次谐波信号的角度分布高度结构化 , 且与激发光的空间分布和介质空间结构密切相关。当介质中散射粒子均匀分布 , 激发光为准直光束时 , 二次谐波的分布为前向。实际上 , SHG现象就是将两入射光子转换成一个出射光子 , 其频率为二次谐波频率。 为保证轴向的动量守恒 , 当两倍入射光子动量的二次谐波光子时 , 其方向须与入射光子前进方向一致 。

谐波成像实验装置

SHG实验装置按二次谐波信号收集方式可分为前向和后向 , 图 2为前向和后向二次谐波产生的实验装置示意图。以图 2 ( a) 为例 ： 由激光器产生的角频率为 ω的入射基频光 , 经过物镜聚焦到样品上 , 产生频率为 2ω的二次谐波 , 由另一个高数值孔径的物镜收集 , 滤光片 (一般为窄带滤光片 ) 滤掉激发光和可能产生的荧光和其他背景光 , 再用探测器件 (如 PMT) 和计算机系统进行信号的采集、存储、分析和显示。

要实现二次谐波显微成像需要对以下因素进行最优化考虑 ： 超短脉冲激光、高数值孔径的显微物镜、高灵敏度的非解扫面探测器、准相位匹配和具有高二阶非线性的样品。

谐波成像激光器

掺 Ti 蓝宝石飞秒激光器因具有高重复频率 (80 MHz) 和高峰值功率，单脉冲能量低且可在整个近红外区 ( 700～1 000 nm ) 内连续调谐 , 所以是二次谐波显微成像的理想光源。激光的重复频率对 SHG也有影响 , 如果提高激发光的重复频率 , 激发光的平均功率可相应提高 , 二次谐波信号也得到增强。

谐波成像物镜

一般情况下 , 二次谐波主要非轴向发射 , 即信号收集时必须有一个足够大的数值孔径来有效接收整个二次谐波信号。

谐波成像滤光片

为保证所收集的信号为二次谐波信号 , 必须使用滤光片。一般采用一长波滤光片和窄带滤光片 (带宽 10 nm)组合以过滤任何干扰信号。

谐波成像信号收集系统

为尽量减少二次谐波信号在系统中的损失 , 提高系统的探测灵敏度 , 最好采用非解扫 ( non-descanned) 的信号。信号收集系统中的主要部件是 PMT探测器。首先 , 为收集整个二次谐波信号 , 需要探测器的接收面足够宽。其次 , 对于由可调谐 Ti 蓝宝石飞秒激光器 , 要接收的二次谐波信号处于 350～500 nm波段 , 故可采用双碱阴极光电倍增管。由于激发光波长离探测器的响应区很远 , 故可有效探测二次谐波信号。除了使用不同的滤光片外 , 二次谐波显微成像和双光子激发荧光显微成像在系统结构上是完全兼容的。 已有人成功地将激光扫描共聚焦显微镜改造成双光子系统, 同样 , 也可以方便的用改造后的系统进行两者的复合成像。

谐波成像发展及应用

目前 , 对二次谐波显微成像的应用 , 主要集中在组织或细胞的成像方面 , 特别是对非中心对称介质 , 如双折射晶体、有序界面和突变处 (如细胞膜和结构蛋白序列等 ) 的研究。

谐波成像二次谐波显微成像与其他成像技术结合

多种成像方法的结合 , 可提供样品不同侧面的信息 , 是目前生物医学成像领域的研究热点。 二次谐波显微成像具有高空间分辨率 , 深成像深度 , 低损伤 , 以及对结构对称性的高度敏感性的特点 , 如果能与其他成像技术结合 , 将成为生物样品研究的有力工具。

谐波成像组织生理学中动力学研究

二次谐波显微是对活细胞、活组织进行成像的一个理想方法。 最近 , 有报道介绍：二次谐波显微技术运用于组织生理学中动力学研究。 如检测肿瘤发展状况, 记录神经细胞中动作膜电压改变等。

谐波成像结论

谐波显微成像因其对微观结构的高灵敏度、高空间分辨率和对生物的低杀伤性特点 , 为活体测量提供了一种新方法 , 有望成为组织形态学和生理学研究的一个强大工具。目前 , SHG在神经科学、药理学及疾病早期诊断方面的应用研究已取得一些进展。但二次谐波成像还是一门不很成熟的技术 , 随着研究的逐步深入 , 对它的应用仍然有待进一步的开发。