血球计数板

血球计数板是一种常用的细胞计数工具，医学上常用来计数红细胞、白细胞等而得名，也常用于计算一些细菌、真菌、酵母等微生物的数量，是一种常见的生物学工具。

血球计数板介绍

血球计数板是一种常用的细胞计数工具，医学上常用来计数红细胞、白细胞等而得名，也常用于计算一些细菌、真菌、酵母等微生物的数量，是一种常见的生物学工具。

血球计数板基本结构

用优质厚玻璃制成。每块计数

其中，中央大方格用双线分成25个中方格，位于正中及四角5个中方格是红细胞计数区域（图中浅红色区域），每个中方格用单线划分为16个小方格。四角的4个大方格是白细胞计数区域（图中浅蓝色区域），每个大方格用单线划分为16个中方格。根椐国际标准局（NBS）规定，大方格每边长度允许误差为±1%。

说明：上图红色方框代表一个大方格；绿色方框代表一个中方格，两种中方格的面积不一样大；蓝色方框代表一个小方格。

计数池分为两种类型。一种是大方格内分为16中格，每一中格又分为25小格即16 × 25 型（希利格式）；另一种是大方格内分为25中格，每一中格又分为16小格即 25 × 16 型（汤麦式）（如图1所示）。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同的特点：即每一大方格都是由16×25=25×16=400个小方格组成。

使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。

在血球计数板上，刻有一些符号和数字，XB-K-25为计数板的型号和规格，表示此计数板分25个中格（即汤麦式）。计数区边长为1mm，则计数区的面积为1mm，每个小方格的面积为1/400mm。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm，每个小方格的体积为1/4000mm。

血球计数板使用方法

视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释100倍），以每小格的菌数可数为度。
取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。
将菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上（不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高），然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。
静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移。将血球计数板放置于显微镜的载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。
计数时若计数区是由16个中方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个中方格（即100小格）的菌数。如果是25个中方格组成的计数区，除数上述四个中方格外，还需数中央1个中方格的菌数（即80个小格）。为了保证计数的准确性，避免重复计数和漏记，在计数时，对沉降在格线上的细胞的统计应有统一的规定。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。即位于本格上线和左线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中。见右图：即本格中计数细胞为3个。
对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2-3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），按公式计算出每mL（g）菌悬液所含细胞数量。
测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。

血球计数板计数公式

红细胞目视计数法的计算公式如下：

红细胞数(RBCs)/L=N/5×25×10×10^6×200

N为：五个中方格的RBC总数

N/5为：5个中方格（粉红色区域）的平均RBC数量（然后推及至中央大方格中每一个中方格RBC的数量）

N/5×25为：中央大方格RBC总数（即：0.1mm（ul）的RBC总数）

N/5×25×10为：

1、mm（ul）RBC总数

N/5×25×10×10^6为：

1、L的RBC总数

200为：血液的稀释倍数

公式简化后：红细胞数/L=N×5×10×稀释倍数

公式前面部分都是换算成每微升血多少该计数细胞；最后都是由微升换算到升，乘以10的6次方

目镜测微尺每格长度=两个重叠刻度间物镜测微尺格数×10/两个重叠刻度间目镜测微尺格数。
以同样方法，分别在不同倍率的物镜下测定测微尺上每格的实际长度。
如此测定后的目镜测微尺的尺度,仅适用于测定时所用的显微镜的目镜和物镜的放大倍数。若更换物镜，目镜的放大倍数时，必须再进行校正标定。

血球计数板缺点

利用血球计数板在显微镜下能直接数出每个小方格中的微生物的个体数目，根据该小格所占的体积，快速地推算出单位体积的溶液中含有的微生物总数。但若菌悬液中不加可以区分细胞死活的试剂时，计数通常计得的是活菌体和死菌体的总和（有时还有微小杂物），还有微小杂物也被计算在内，这样得出结果往往偏高，因此此法适用于体积较大的单细胞微生物的计数。

血球计数板注意事项

镜检计数室。因前一次清洗不到位，或者保存过程中存在污染，更或者因操作不当导致的计数室存在划痕，若不及时清洗或更换，则会对后期实验计数产生极大影响。所以，在每次使用血球计数板之前都需要加一步镜检计数室，如若在镜检时发现计数室有污物，则需按要求清洗并吹干后再进行实验。
摇匀后取液。在吸出培养液进行计数之前，需轻轻震荡试管，使菌体分布均匀，防止聚沉淀，从而提高计数的代表性和准确性。
先盖血盖片后加菌液。在菌悬液摇匀后，应先在血球计数板上盖上血盖片，再用滴管吸取少许菌悬液，从计数区中间平台沿血盖片的上边缘滴入一小滴菌悬液，利用液体的表面张力一次性充满计数区。若先加菌液再覆盖血盖片，则容易因为菌液加入过多，而导致血盖片未与血球计数板支持柱接触，血盖片浮于菌液上方而导致最后计数偏大，同时会因为有气泡产生而导致计数偏小。
静置片刻再计数。静置5 min，待菌悬液不再漂浮流动，酵母菌全部沉降后再将血球计数板放到显微镜下进行计数。先在低倍镜下找到需要观察计数的大方格及中方格，将中方格移到视野中央，然后拨动转换器移至高倍镜进行计数。
高倍镜下调亮度。低倍镜下，用平面镜和小光圈，可以清晰地看到血球计数板上的酵母菌。但是，拨动转换器换到高倍镜后，即使是用了平面镜和最小光圈，视野里往往还是白茫茫一片，什么都看不见，这时候可以尝试操作遮光器上的金属遮光片进行遮光处理。因为活的酵母菌和培养液的折光率相近，所以要在高倍镜下将视野调得暗一些。
掌握计数原则。一般选择观察的菌液浓度控制在每个小方格内有4或5个菌体为宜，若其浓度太高，可适当稀释；并采用“计上不计下，计左不计右”的计数原则。

血球计数板误差控制

血细胞计数的误差分别来源于技术误差和固有误差。其中由于操作人员采血不顺利，器材处理、使用不当，稀释不准确，细胞识别错误等因素所造成的误差属技术误差；而由于仪器（计数板、盖片、吸管等）不够准确与精密带来的误差称仪器误差，由于细胞分布不均匀等因素带来的细胞计数误差属于分布误差或计数域误差（filederror）。仪器误差和分布误差统称为固有误差或系统误差。技术误差和仪器误差可通过规范操作、提高熟练程度和校正仪器而避免或纠正，但细胞分布误差却难于彻底消除。因此，搞好红细胞计数的质量控制一般需采用以下措施。

1．避免技术误差，纠正仪器误差

（1）所用器材均应清洁干燥，计数板、血盖片、微量吸管及刻度吸管的规格应符合要求或经过校正。

①计数板的鉴定：要求计数室的台面光滑、透明，划线清晰，计数室划线面积准确。必要时采用严格校正的目镜测微计测量计数室的边长与底面积，用微米千分尺测量计数室的深度。美国国家标准局（NBS）规定每个大方格边长的误差应小于1%，即1±0.01mm，深度误差应小于2%，即0.1±0.002mm。若超过上述标准，应弃之不用。

②血盖片应具有一定的重量，平整、光滑、无裂痕，厚薄均匀一致，可使用卡尺多点测量（至少在9个点），不均匀度在0.002mm之内。必要时采用平面平行仪进行测量与评价，要求呈现密集平行的直线干涉条纹。最简单的评价方法是将洁净的盖片紧贴于干燥的平面玻璃上，若能吸附一定的时间不脱落，落下时呈弧线形旋转，表示盖片平整、厚薄均匀。同时，合格的盖片放置在计数室表面后，与支持柱紧密接触的部位可见到彩虹。精选出的盖片与其他盖片紧密重合后，在掠射光线下观察，如见到完整平行的彩虹条纹表示另一枚盖片质量也符合要求。

③临床实验室多采用一次性微量采血管采集毛细血管血，除注意定点购买使用信誉较好厂家的产品外，还应对每一批量的采血管进行抽样检查，可通过水银称重法或有色溶液比色法进行校正，误差不应超过±1%。

（2）红细胞稀释液应等渗、新鲜、无杂质微粒。

（3）严格操作，从消毒、采血、稀释、充池到计数都应规范，尤其应注意的是血样稀释及充池时既要作到充分混匀，又要防止剧烈震荡为破坏红细胞。必须一次性充满计数室，防止产生气泡，充入细胞悬液的量以不超过计数室台面与血盖片之间的矩形边缘为宜。

（4）报告法定计量单位。

2．缩小计数域误差及分布误差

缩小计数域误差或分布误差由于血细胞在充入计数室后呈随机分布或称Poisson分布（），而我们所能计数的细胞分布范围是有限的，由此造成的计数误差称为计数域误差或分布误差。缩小这种误差的有效方法就是尽量扩大细胞计数范围和计数数目，一般先进行误差估计，然后决定所需计数的数目和计数范围，只要能将误差控制在允许范围内即可。

Berkson指出，当使用同一支吸管、同一面计数室，计数0.2mm面积的细胞数，有望将CV控制在可接受的7%以内。对于红细胞计数而言，由于红细胞数量较多，在计数室中显得比较“拥挤”，根据Poisson公式推断。欲将误差控制在变异百分数5%以内，至少需要在计数室中计数400个红细胞，因此要求计数五个中方格的红细胞。事实上Berkson还通过实验证明，红细胞的计数域误差为s=0.92，较理论误差（Poisson分布误差）要小。

3．降低异常标本的干扰误差

排除异常标本的干扰白细胞数量在正常范围时，相对于红细胞数量来讲，其影响可忽略，但如白细胞过高（>100×10/L），则应对计数结果进行校正。方法是：

①实际RBC=计得RBC-WBC。如当红细胞换算后为3.5×10/L、白细胞换算后为100×10/L时，病人实际红细胞数应为3.4×10/L。

②在高倍镜下计数时，避开有核细胞。有核细胞体积比正常红细胞大，中央无凹陷，无草黄色折光，可隐约见到细胞核。此外，当病人急性严重贫血时网织红细胞可提前大量释放，也给红细胞计数带来一定的干扰，而且影响网织红细胞绝对值计算结果。其校正方法有待探讨。