正负选择

转染DNA与内源基因组DNA之间的同源重组事件，是由转染DNA的自由末端激发的。发生在哺乳动物细胞中的情况与酵母细胞的比较，最主要的差别在于，前者转染DNA发生随机整合的机率相当高，而同源重组的频率则相当低。正是由于这种缘故，给哺乳动物细胞的基因打靶事件的检测造成了很大的困难。

正负选择介绍

转染DNA与内源基因组DNA之间的同源重组事件，是由转染DNA的自由末端激发的。发生在哺乳动物细胞中的情况与酵母细胞的比较，最主要的差别在于，前者转染DNA发生随机整合的机率相当高，而同源重组的频率则相当低。正是由于这种缘故，给哺乳动物细胞的基因打靶事件的检测造成了很大的困难。

为了克服这种困难，已经发展出了一种用于富集基因打靶事件或说是同源重组事件的特殊的试验体系，它涉及到正选择和负选择两个重要内容，所以特称为正负选择(positive-negative selection)法。为此需在基因打靶载体中克隆上两个选择标记基因。其中r-neo基因叫做正选择标记基因，它编码的新霉素磷酸转移酸可抑制抗菌素G418的活性。因此，获得了r-neo基因的转化细胞，能够在含有G418抗菌素的选择培养基中生长、存活。HSV-tk基因叫做负选择标记基因，它编码的单纯疟疾病毒胸苷激酶，可以把9-{1,3-二羟-2-丙氧甲基}鸟嘌呤(ganciclovir，一种核苷的类似物)，转变成为毒性的核苷酸(三磷酸形式，正常小鼠中表现为单核苷酸类似物)，造成细胞中毒死亡。因此，选择培养基中的GCV能够特异性地杀死表达HSV-tk基因的转化细胞。