反硝化，也称脱氮作用，是指细菌将硝酸盐（NO3）中的氮（N）通过一系列中间产物（NO2、NO、N2O）还原为氮气（N2）的生物化学过程。参与这一过程的细菌统称为反硝化菌。
反硝化菌在无氧条件下，通过将硝酸盐（NO3）作为电子受体完成呼吸作用（respiration）以获得能量。这一过程是硝酸盐呼吸（nitrate respiration）的两种途径之一，另一种途径是是硝酸异化还原成铵盐（DNRA）。
微生物吸收利用硝酸盐有两种完全不同的用途，一是利用其中的氮作为氮源，称为同化性硝酸还原作用：NO3 →NH4 →有机态氮。许多细菌、放线菌和霉菌能利用硝酸盐做为氮素营养。
另一用途是利用NO2和NO3为呼吸作用的最终电子受体，把硝酸还原成氮（N2），称为反硝化作用或脱氮作用：NO3 →NO2 →N2↑。能进行反硝化作用的只有少数细菌，这个生理群称为反硝化菌。大部分反硝化细菌是异养菌，例如脱氮小球菌、反硝化假单胞菌等，它们以有机物为氮源和能源，进行无氧呼吸。
总的反硝化过程可以用以下方程式表示：
2 NO3 + 10 e + 12 H → N2+ 6 H2O, ΔG = −333 kJ/mol其中包括以下四个还原反应还原反应：
硝酸盐（NO3）还原为亚硝酸盐（NO2）：2 NO3+ 4 H + 4 e → 2 NO2+ 2 H2O
以上四个反应均为放热反应，所以在无氧或缺氧条件下，细菌可以将硝酸盐（NO3）作为电子传递链(ETC)的最终电子受体（TEA, terminal electron acceptor），来完成物质能量交换。
反硝化菌在自然界以各种形式广泛存在，如：
Paracoccus denitrificans（自养，氧化氢气H2）Thiobacillus denitrificans（自养，氧化硫化物（S）或者硫代硫酸盐（S2O3））Pseudomonas stutzeri（异养，氧化有机碳）反硝化菌主要为原核生物，大量存在于在α-, β- 和γ-变形菌纲中。已知的反硝化菌的属有Achromobacter, Acinetobacter, Agrobacterium等。
大部分反硝化细菌是异养菌，例如脱氮小球菌、反硝化假单胞菌等，它们以有机物为氮源和能源，进行无氧呼吸。少数反硝化细菌为自养菌，如脱氮硫杆菌，它们氧化硫或硝酸盐获得能量，同化二氧化碳，以硝酸盐为呼吸作用的最终电子受体。
在污水生化处理过程中，能为反硝化细菌利用的碳源主要有污水中的碳源以及外加碳源。如果能够利用污水中的有机碳作为碳源是比较经济的。这要求污水中的BOD5/TN值大于3-5，如果不满足要求则需外加碳源。常用的外加碳源为甲醇，因为甲醇被分解后主要生成二氧化碳和水，不残留任何难降解的物质，而且反硝化速率高。
pH值是反硝化过程的重要影响因素，反硝化细菌最适的pH值范围为7.0-8.0，此时的反硝化速率最高；当pH值不在此范围内时，反硝化速率明显下降。
反硝化细菌是异养兼性菌，只有在无分子氧的条件下反硝化菌才能利用硝酸盐或亚硝酸盐中的氧进行呼吸，使氮原子得到还原。如果反应器中的溶解氧浓度过高，分子态氧成为供氧物质，将使硝酸氮的还原过程受到抑制。
反硝化细菌的最适生长温度为20-40℃，低于15℃时，反硝化速率明显降低。因此，在冬季低温季节，为了保持一定的反硝化速率，需要提高污泥停留时间，同时降低负荷，提高污水的停留时间。
农业生产方面，反硝化作用使硝酸盐还原成氮气，从而降低了土壤中氮素营养的含量，对农业生产不利。农业上常进行中耕松土，以防止反硝化作用。
在环境保护方面，反硝化反应和硝化反应一起可以构成不同工艺流程，是生物除氮的主要方法，在全球范围内的污水处理厂中被广泛应用。
利用硝化作用和反硝化作用去除有机废水和高含量硝酸盐废水中的氮，来减少排入河流的氮污染和富营养化问题，已是环境学家的共识。利用各种反应器处理城市的或其他废水时，有机废水中的碳源可支持反硝化作用，进行有效的生物脱氮。污水处理中所利用的反硝化菌为异养菌，其生长速度很快，但是需要外部的有机碳源，在实际运行中，有时会添加少量甲醇等有机物以保证反硝化过程顺利进行。
反硝化作用能造成氮肥的巨大损失，从全球估计，反硝化作用所损失的氮大约相当于生物和工业所固定的氮量。施用硝化抑制剂可收到良好的效果。
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