马铃薯黄化矮缩病毒,所属病毒界,分布在加拿大、美国。
Potato yellow dwarf virus,简称PYDV.
异名: 纽约马铃薯黄矮病毒(SYDV-NY(New York)),CYDV又称 Aureogens vastans ar.agalliae和新泽西马铃薯黄矮病毒(SYDV-NJ(New Jersey))。
英文名:Potato yellow dwarf virus
分类地位:属弹状病毒组(Rhabdoviruses)。分布加拿大、美国。
马铃薯黄矮病毒能侵染双子叶植物的茄科、菊科、十字花科、唇形科、豆科、蓼科和玄参科植物60余种,自然寄主有马铃薯、花烟草(Nicbtiana alata)、万寿菊、Chrysanthermum leucanthemum var.pinuatifidum、百日菊、白三叶草、长春花、山芥(Barbarea vulgaris)等。
马铃薯病株矮缩、黄化,茎的生长点早期坏死。植株上部的茎常开裂,由开裂处可看到茎节的髓部及皮层有锈色斑点,有时节间的髓部及皮层也出现锈斑。病株节间缩短,可产生丛枝现象。小叶通常卷曲,但有时也皱缩,块茎小而少,块茎与茎部的距离很近,有时块茎也开裂。块茎的髓部及韧皮部有锈色至褐色的斑点或变色部分,维管束很少变色。收获后不久的块茎,其中部的芽端这种变色斑表现得特别明显,但茎端在田间一般不被侵染。若在土温较高的地块播种病薯块,幼芽死于土中,有的即使能出土,幼苗很快就表现出各种症状,以至死亡。若将病薯块播种在冷凉的气候条件下,则植株症状 "隐蔽",所结的薯块也不减少,薯块内部也不出现变色部分。
马铃薯黄矮病毒为杆菌状粒体,在植物切片中大小约为380×75nm,在介体单层细胞切片中较小一些。病毒外膜由厚约3.5nm和间隔约5nm的三层构成。该病毒具有多形性,即电镜观察时可因处理方法不同而呈多种不同的形态,提纯病毒负染也会呈多种形状,病组织超薄切片中,其形态也不完全一样。形态的多形性是因病毒粒体易变形,是在磷钨酸等化学物质处理或因脱水而产生的人为假象。若从病组织抽提病毒之前用锇酸或戊二醛固定,最后负染可以保护病毒粒体不被破坏,而呈现稳定的形态。
病毒核酸为单链RNA,分子量约为4.3×106。病毒粒体含有20%的类脂,有4~5种结构蛋白。病毒免疫原性较强。黄花烟汁液中的马铃薯黄矮病毒在23℃~27℃可保持侵染性2.5~12小时,稀释限点10-3,致死温度为50℃。
根据介体专化性,PYDV可分为两个株系:
(1)SYDV:由三叶草叶蝉 (Accratagallia sanguinolenta)传毒,而Agallia constricra不能传。
(2)CYDV:由 Agallia constricta传,而三叶草叶蝉不能传。SYDV和CYDV病毒粒体的结构蛋白有差异。致病力不同的毒株可以从PYDV的原发病斑上分离出来。Black曾根据致病力不同将PYDV分为7个毒株。当病毒在黄花烟上长期不经介体传播则易变异为介体传播较差的毒株或根本不能由介体传播的毒株。
马铃薯种薯、介体、嫁接均可传毒,主要靠叶蝉(Accratagaliia spp.)、Agallia spp.传播。叶蝉在传毒能力上有严格的专化性,Accratagallia sanguinolenta传SYDV的能力较强,Agallia quadripunctata较弱,Agallia constricta完全不能传。Agallia contricta可传CYDV,但Ac-cratagallia sanguinolenta不传。 Agallia quadripunctata传播CYDV比传播SYDV强。病毒在介体内可增殖。传毒叶蝉从吸毒到传播需6~10天,病毒在虫体内可以存活50天之久。若虫、雌、雄成虫均能传毒,病毒还能在成虫体内越冬。有些实验中,SYDV和CYDV不能通过卵和精子传代,但另一些实验指出CYDV也偶尔通过卵传。在马铃薯植株间难以通过机械接触传毒。汁液接种只能感染黄花烟、心叶烟和马铃薯等少数寄主。
鉴别寄主反应
马铃薯(Solanum tuberosum)嫁接 叶蝉可以将PYDV传到马铃薯上,针刺法接种平均成功率为13.7%。而最简单的方法是汁液摩擦接种。做汁液摩擦接种时应注意:a.暗处理:在接种前把植株置黑暗处一定时间可提高接种效率,若接种前连续光照7小时以上则接不上;b.温度为26~27℃或稍高最适;c.在接种汁液中加入0.01M盐酸半胱氨酸可使接种效率提高2倍;d.植株中部叶片比上端嫩叶及下部的老叶更易接种;e.接种前去除顶尖,利于发病。感病马铃薯植株,顶端黄化和坏死,茎内部有坏死斑点,特别在高部节位上病植株矮缩,块茎内部有坏死斑点,有时畸形、皱缩、变水。病株很少存活,存活时慢性症状较轻。
黄花烟(Nicotiana rustica) 接种黄花烟是研究PYDV的最好寄主,易于摩擦接种,接种前暗处理18~24小时可提高接种效率2~4倍,接种后温度保持26~27℃或稍高对发病较适宜,接种前病汁液中加入0.01~0.04M盐酸半胱氨酸可延长病毒存活期并利于接种。生长旺盛的植株易于接种,展开的嫩叶及其下部的老叶用于病斑计数较好,去除生长点和不接种叶片有利于病斑的形成和发展。
pH7.0较6.5、7.5更适于SYDV接种黄花烟。用H15-MgCl2液化比磷酸缓冲液效果好。健康的黄花烟汁液和高浓度的蔗糖可以增加在黄花烟接种PYDV产生的病斑数,蔗糖浓度为50~600g/L可成比例地增加病斑。摩擦接种时在缓冲液中加蔗糖比不加多产生7倍的病斑。摩擦接种适当的黄花烟叶片,1周左右接种叶出现局部不规则的黄色原发病斑,以后幼叶黄化斑驳,有时茎上有淡绿色或黄色浅条纹,慢性症状则轻微。植株呈系统性症状较为缓慢。
深红三叶草(Trifolium incarnatum) 接种可经介体接种或用针刺法接种。用 SYDV接种幼嫩叶出现系统明脉,最后植株死亡。用CYDV接种,老叶上先出现系统症状,再出现褐色锈斑和线纹,SYDV无此症状。植株虽受CYDV的急性感染,但通常能存活。
介体细胞单层培养
1967年Chiu等建立了Agallia constricta的细胞系和其单层细胞培养的保存方法,取产后7天的卵,将幼胚胎移植,将许多胚组织片放在少量培养基上,置培养皿内在室温24℃培育,24~18小时后新细胞出现并逐渐形成一细胞层,吞噬原始培养细胞,这种培养物可通过每周更换培养基而存活几个月。培养基配方,100ml培养基溶液含400mgd-葡萄糖,105mg NaCl,80mg KCl,185mg MgSO4·7H2O,650mg水解乳白蛋白,500mg"Yea'stolate",17.5~20ml胎牛血清,10000?g青霉素,35mg Na2CO3,30mg CaCl2,250?g两性霉素,5000?g新霉素。
无机盐可先配成两种溶液:a.除碳酸氢钠以外的盐溶液(为最终浓度的5倍),用滤器灭菌;b.碳酸氢钠溶液(为最终浓度10倍),用高压灭菌。葡萄糖液(4g/100ml)、水解乳白蛋白(3.25g/ml)和"Yea'stolae"(5g/100ml)用滤器灭菌。胎牛血清置56℃加热30分钟,用前加入。抗生素可在最后定溶为 100ml时加入。最终溶液的酸碱度为pH7.0,无需调整。后来的研究表明:培养基中胎牛血清的浓度降为20%和10%培养效果不变。
1970年Chiu等又成功地将PYDV接入Aceratagallia sanguinolenta的单层培养细胞中。接种方法:移去培养基,用培养基(不含牛血清)洗2次,加上接种物液在30℃培育3小时,而后再洗3次,置培养基上培养。接种物液的准备方法:先提纯、做密度梯度离心,取PYDV带,每个步骤均要无菌操作。病毒悬浮于灭菌的pH7.0溶液中(含0.01M MgCl2、0.01M甘氨酸),再用培养基(含0.5%牛血清,无胎牛血清)稀释即可做为接种液。PYDV接种2天后感染的细胞可用特异荧光抗体染色计数。来自Aceratagallia saeguinolenta的细胞称为AS细胞,来自Agallia constricta的细胞为AC细胞。SYDV对AC细胞的侵染性是对AS细胞侵染性的10%,CYDV对AS细胞的侵染性是对AC细胞侵染性的10%。但后来有报道说:AC、AS细胞可以同样均等地感染CYDV和SYDV。SYDV还可以侵染来自Dalbulus elimatus的DE细胞这一非介体细胞,但侵染性很低,仅为AS细胞的0.0027倍,而CYDV则不能侵染DE细胞。
用介体细胞单层培养检测SYDV的侵染性较黄花烟叶片精确得多,前者较后者敏感103.7倍(以稀释限点计算前者是后者的300倍,以单位面积的杂数计算前者较后者精确104.5倍),实验表明后者的变异系数为52~109%,而前者仅为 6~11%。用黄花烟叶片检测受叶龄、温度、光照强度等影响,这些因素又较难控制,而用介体细胞单层培养则可消除这些影响。黄花烟叶片检测需要2周,而介体细胞单层培养仅需2天。
血清学反应
Lin等报道用胶体金技术可检测感马铃薯黄矮病毒的烟草叶片中的病毒蛋白。Lin等报道,采用接种介体单层培养细胞的方法(可用免疫荧光抗体技术检测是否感染),把中和反应用于马铃薯黄矮病毒的检测效果很好,其灵敏度较环状沉淀反应高100倍。
马铃薯黄矮病毒是我国公布的《中华人民共和国进境植物检疫危险性病、虫、杂草名录》中的一类危险性病毒,并在《中华人民共和国进境植物检疫禁止进境物名录》中规定应禁止从疫区引种,经审批特许的,应在国家指定的隔离检疫圃内试植检查,对传毒介体、昆虫亦应严格检疫。