由接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来。
术语简介
平板划线分离法（streak plate method）
如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。
操作步骤
①在培养皿中注入适当的培养基。
②用沾有少量待纯化培养物的接种环在已凝固的培养基表面轻轻划线（以不划破琼脂为度），划线方式主要有以下两种：按图3-8A在琼脂表面轻轻划第1区的三条线（注意接种环与平板表面成20°~30°角），将培养皿转动90°，烧接种环，连着1区第三条线1-c划第二区的2-a，然后单划2-b、2-c，再将培养皿转90°，烧接种环，连着2-c划第3区的3-a，然后单独划3-b、3-c；或按图3-8B在琼脂表面划4~5条线为第1区，培养皿转动70°，烧接种环，与1区交叉划4~5条线为第2区，依法划第3、4区。
③培养一定时间后，挑取单个菌落转接于琼脂斜面。
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