多孢分离指把多个孢子接种在同一培养基上，让它们萌发共同生长交错在一起，从而获得纯种的一种方法，由于多个孢子间的种性互补，基本上可以保持亲本的稳定性，此法比较简易。
按无菌操作规程，用无菌接种环从收到孢子的滤纸条上沾取少量孢子，在PDA试管斜面培养基上自下而上划线，划线时勿用力，以免划破培养基表面，接种完毕，抽出接种种灼烧试管口，塞上棉塞，放置24°C恒温培养箱中培养，待孢子萌发后（一般约15-20天），挑选萌发快，长势旺的菌落，转接于新试管培养基上再行培养。
按无菌操作方法，取一小块具有孢子的滤纸条，放入装有无菌水的小三角瓶中，充分摇匀制成孢子悬浮液，然后用已灭菌的试管，吸取孢子悬浮液，滴1-2滴到PDA试管或培养皿培养基上，转动试管使孢子悬浮液均匀分布于斜面上，或用玻璃涂布棒将平板上的悬浮液涂布均匀。孢子在培养基上经24°C恒温培养萌发后，挑选几株发育匀称，生长速度快的菌落，移接于另一试管斜面培养基上，恒温培养即为母种。
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